Глава 7

 

 

Подход, основанный на инициации дальнейшей дифференцировки трансформированных клеток, при которой они утрачивают способность к самовоспроизведению, уже известен в онкологии. Однако среди многочисленных препаратов с противоопухолевой активностью только две их группы обладают способностью индуцировать клеточную дифференцировку. Это вещества из группы ретиноидов (витамин А и его аналоги) и вещества, влияющие на спектр метилирования генов, т.е. на эпигенетическую регуляцию клеток. В клинической практике пока применяются только ретиноиды. Установлено, что они являются модуляторами дифференцировки и пролиферации эпителиальных клеток и способны инвертировать процессы онкогенеза, влияя на внутриклеточные сигнальные каскады через ядерные ретиноидные рецепторы (26).
Имеются убедительные практические результаты, свидетельствующие об эффективности такого подхода. Так, успехи в лечении острого промиелоцитарного лейкоза на сегодняшний день в значительной степени связаны с назначением ретиноидов после курса химиотерапии. Применяя препарата ретиноидного ряда, почти в 90% вновь диагностируемых случаев удается добиться стойкой ремиссии и в 70% случаев - полного излечения (20). Однако применение ретиноидов при лечении солидных опухолей не дало ожидаемого эффекта.
Другое важное направление “дифференцировочной терапии” - это химиопрофилактика, направленная на предотвращение перехода начальных, предраковых состояний в инвазивный рак (29).    
В литературе активно обсуждается значение мутаций в генах-cупрессорах опухолевого роста BRCA1 (BreastCancerAssociated 1) (хромосома 17q21) и BRCA2 (хромосома 13q12)при развитии рака груди. Напомним, что герминальные мутации (мутации в половых клетках) генов BRCA1 и BRCA2, приводящие к потере ими опухоль-супрессорной функции, детерминируют наследственную предрасположенность к развитию рака груди и яичников и повышают риск развития этих заболеваний до 85% (19). У больных с генетическими аномалиями генов BRCAчаще развивается высокодифференцированный гормон-независимый рак, склонный к рецидивам и имеющий худший прогноз. Как правило, такая опухоль развивается в молодом возрасте с высокой частотой развития рака в противоположной железе и высокой степенью злокачественности.
Общепризнано, что как в гормончувствительных, так и в гормон-резистентных клетках молочной железы белки BRCAучаствуют в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, а также поддерживают стабильность генома в целом. В связи с этим нарушения экспрессии гена BRCA1 приводят к возникновению дополнительных мутаций в стволовых клетках, в том числе и мутаций в гене-супрессоре опухолевого роста р53, что инициирует необратимую трансформацию клеток молочной железы (2, 33).Кроме того, белки BRCA1и BRCA2 могут взаимодействовать с различными факторами транскрипции и ремоделирующими белками хроматина и таким образомфункционировать как регуляторы транскрипции генов, ответственных за выживаемость клетки (5, 24). Есть весьма убедительные данные, свидетельствующие о роли белка BRCA1 в качестве супрессора инвазивной и метастатической клеточной активности при спорадических формах рака (25, 31).
Показано, что опухоли, развивающиеся на фоне мутации гена BRCA1,  характеризуются отсутствием экспрессии рецепторов ER, PR и HER2/neu(что определяет их особую злокачественность) и выраженной экспрессией маркеров базального эпителия (32). Данная закономерность легла в основу предположения о том, что ген BRCA1 участвует в процессах созревания и дифференцировки стволовых клеток молочной железы. Это предположение впервые было высказано в 2004 г. независимо двумя группами авторов (7, 11). По их мнению, рак груди развивается из стволовых клеток, которые по каким-то причинам не могут завершить процесс дифференцировки, но при этом сохраняют способность к самовоспроизведению и активной пролиферации.
Экспериментальные доказательства, подтверждающие справедливость этой гипотезы, были получены в работе, опубликованной четыре года спустя (16). В качестве модели авторы использовали систему культивирования invitro, в которой стволовые клетки обладали способностью размножаться и образовывать так называемые “маммосферы”. Эти образования представляют собой флотирующие клеточные конгломераты, содержащие небольшое количество стволовых клеток, способных к самовоспроизведению, и прогениторных клеток, дифференцирующихся в эпителиальные и миоэпителиальные клетки (6). Прикрепление “маммосфер” к коллагеновым носителям является сигналом к дифференцировке клеток, которая сопровождается 4-х-кратным повышением активности гена BRCA1 как на уровне образования мРНК-транскрипта, так и на уровне экспрессии кодируемого им белка.
Для получения прямых доказательств участия гена BRCA1 в регуляции дифференцировки был использован изящный прием блокады его экспрессии с помощью антисмысловых мРНК. Эти эксперименты показали, что “выключение” гена BRCA1 блокировало образование “маммосфер” при последующих пассажах, что, по мнению авторов, свидетельствует об ингибировании основной функции стволовых клеток - их способности к самовоспроизведению. Как было установлено ранее, стволовые клетки молочных желез мыши и человека не экспрессируют эстрогеновые рецепторы (ER), однако способны дифференцироваться в ER-позитивные клетки (4, 27).  
Авторы цитируемой статьи задались вопросом о влиянии гена BRCA1 на уровень экспрессии ER в процессе созревания стволовых клеток молочной железы. Оказалось, что блокада экспрессии BRCA1 приводила к 10-кратному снижению синтеза ER. На основании полученных результатов авторы приходят к однозначному заключению о том, что ген BRCA1 определяет дифференцировку ER-негативных стволовых клеток в ER-позитивные эпителиальные клетки. Для подтверждения обнаруженной закономерности были поставлены эксперименты invivo на специально выведенной породе мышей. При этом созревание стволовых/прогениторных клеток invivo оценивали по экспрессии эмбрионального маркера ALDH1 и эстрогеновых рецепторов (ER). Полученные результаты подтвердили предположение об участии гена BRCA1 в созревании стволовых клеток молочной железы. Таким образом, можно считать доказанным тот факт, что ген BRCA1 необходим для созревания стволовых клеток с фенотипом ALDH1(+)/ ER(-) в эпителиальные клетки с фенотипом ALDH1(-)/ ER(+) (рис. 9).
На следующем этапе исследований был проведен анализ биопсийного материала, полученного у женщин с диагнозом “рак молочной железы”, в анамнезе которых имелись подтвержденные данные о наличии мутаций в гене BRCA1 (по сравнению со здоровой тканью молочной железы). В 5 образцах из 13 были выявлены зоны, которые интенсивно окрашивались антителами к маркеру стволовых клеток ALDH1 и не экспрессировали эстрогеновые рецепторы. Ни в одном из контрольных образцов не были обнаружены ALDH1-позитивные клетки.
Особый интерес представляют результаты многолетних наблюдений над обследованными женщинами. Из тринадцати носителей мутаций гена BRCA1 у шести женщин в течение 9 лет развился рак груди. При этом диагноз “рак молочной железы” был поставлен четырем из пяти носителей мутаций, положительных по ALDH1-маркеру, и только двоим из восьми носителей мутантного гена, негативных по ALDH1. На этом основании авторы уверенно заключают, что задержка в созревании стволовых/прогениторных клеток, обусловленная нарушениями в экспрессии гена BRCA1 и проявляющаяся в увеличении соотношения маркеров ALDH1(+)/ER(-), является начальной стадией канцерогенеза молочных желез.
Мы подробно остановились на результатах данной работы (16), поскольку это первое экспериментальное исследование, подтверждающее прямую связь между хорошо известным генетическим дефектом, обуславливающим развитие семейного рака груди, и ролью стволовых клеток в развитии этой патологии. А кроме того, в настоящее время в литературе активно обсуждается значимость гена BRCA1 и при пролиферативных патологиях предстательной железы.
Хотя рандомизированные эпидемиологические исследования не обнаружили прямой зависимости между носительством мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 и неопластическими процессами в предстательной железе (15, 28), к настоящему моменту накоплено достаточное количество экспериментального материала, свидетельствующего о том, что гены BRCAи кодируемые ими белки выполняют функции опухолевых супрессоров не только в клетках молочной железы и яичников, но и в клетках простаты. Остановимся на этих данных более подробно.
В экспериментах на ген-трансфицированных клеточных культурах invitro(10), а также на животных моделях invivo(23) изучались молекулярные механизмы, посредством которых герминальные мутации генов BRCA1 и BRCA2 влияют на функционирование опухолевых клеток простаты. Было показано, что опухоль-супрессорные функции генов и белков BRCA в простатических клетках проявляются в виде широкого спектра противоопухолевых активностей. В частности, установлено, что в тканях простаты ген/белок BRCA1:
1) негативно регулирует клеточную пролиферацию;
2) принимает участие в процессах ДНК-репарации/рекомбинации, критичных для поддержания целостности генома;
3) индуцирует апоптоз трансформированных и поврежденных клеток;
4) модулирует транскрипцию и экспрессию ключевых клеточных регуляторных белков (BRCA2, p300, MDM-2, p21WAF1/CIP1, Bax, Bcl-2);
5) существенно (в 3-6 раз) повышает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам (Адриамицину, Камтотецину, Таксолу).
Установлено, что некоторыми из указанных свойств обладает также ген/белок BRCA2 (23).
Есть данные о том, что BRCA1 способен модулировать активность AR-сигнальных каскадов и тем самым оказывать влияние на пролиферацию нормальных и малигнизированных простатических клеток, физически контактируя с андрогеновыми рецепторами и коактиваторным белком р160, взаимодействующим с рецепторами глюкокортикоидов (21).
Другими авторами было установлено, что в результате кооперативного взаимодействия андрогеновых рецепторов и белка BRCA1 усиливается экспрессия ингибитора циклин-зависимых киназ – белка p21WAF1/CIP1 (3, 13)(как отмечалось выше, белок BRCA1 может активировать р21 и самостоятельно). Есть мнение, что через взаимодействие BRCA1 и ARи последующую активацию экспрессии белка р21 осуществляется андроген-индуцированная клеточная гибель трансформированных клеток простаты (34).
Как известно, помимо андрогеновых рецепторов, простатические клетки содержат взаимодействующие с женскими половыми гормонами эстрогеновые рецепторы (ER), доминирование функции которых в пожилом возрасте играет важную роль в развитии гиперпластических и опухолевых заболеваний. Функциональную основу ER составляют два трансактивационных домена (активных центра) AF-1 и AF-2, опосредующих активацию (ингибирование) транскрипции эстроген-индуцибельных генов (12, 14). Активность AF-1-домена, расположенного в N-концевой ДНК-связывающей области молекулы рецептора, является конститутивной и не зависит от взаимодействия с эстрогенами. В отличие от него активация домена AF-2, расположенного в С-концевой области взаимодействия гормона с рецептором, носит гормон-зависимый характер. Экспериментально установлено, что белок BRCA1 ингибирует активность домена AF-2 в эстрогеновых рецепторах ERaне только в эстроген-зависимых и эстроген-независимых опухолевых клетках молочной железы, но также и в андроген-зависимых (LNCaP) и андроген-независимых (DU145) опухолевых клетках простаты (9).
В настоящее время проводятся исследования по изучению связи мутаций в генах BRCA и частотой появления спорадических раков, в том числе рака предстательной железы. Было, в частности, установлено, что в клеточных линиях опухолевых или иммортализованных простатических эпителиальных клеток TSU-Pr1 и DU145 (андроген-независимого РП) отмечается повышенный уровень экспрессии впервые обнаруженного нового BRCA2-мРНК-транскрипта, несущего в своем составе специфическую мутацию (делецию) в области рамки считывания экзона 12 (BRCA2delta 12). В то же время BRCA2-мРНК-транскрипты дикого типа в клетках РП (линия DU145) практически не детектировались. Аналогичная ситуация имела место в клеточных культурах рака яичников (OVCA420, ALST, DOV13, SCOV3) и гормон-зависимого рака молочной железы (MCF-7) (22).
Пока нет данных о влиянии гена BRCA1 на созревание стволовых клеток простаты, однако нельзя исключить того, что влияние экспрессии этого гена на дифференцировку стволовых клеток имеет универсальный характер и проявляется не только в отношении стволовых клеток молочной железы, но и стволовых клеток простаты. А если это так, то восстановление или усиление его экспрессии у носителей мутантных аллелей может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и, таким образом, предупреждать развитие опухолей. Препарат Индигал®, разработанный компанией “МираксБиоФарма”, в качестве одного из действующих веществ содержит индол-3-карбинол (I3C), который является природным индуктором экспрессии гена BRCA1 (18). В настоящее время в литературе имеются данные о том, что I3Cповышает уровень экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 дозо-зависимым образом не только в опухолевых клетках молочной железы (линии MCF-7 и T47D), но и андроген-зависимых (LNCaP) и андроген-независимых (DU145) клетках рака простаты (8). Причем индукция экспрессии генов BRCAнаблюдается при низких дозах индол-3-карбинола (20 мкМ), что дает основание говорить о потенциальной роли I3Cв качестве химиопрофилактического средства и в данном случае. Показано также, что в результате I3C-опосредованной активации гена/белка BRCA1 происходит активация гена/белка BRCA2. Этими же авторами было установлено, что ингибирование в присутствии I3Cактивности эстрогеновых рецепторов, стимулированной эстрадиолом, а также лиганд-индуцибельной активности андрогеновых рецепторов опосредовано белком (геном) BRCA1.
Еще один способ модуляции процесса клеточной дифференцировки основан на модификации хроматина. Фермент гистон-деацетилаза регулирует ацетилирование гистонов, катализируя удаление ацетильных групп с N-концевых остатков лизина в составе нуклеосомных гистонов. Изменения в спектре ацетилированных гистонов отражаются на транскрипционной активности генов, что отмечено при некоторых онкологических заболеваниях человека (30). Показано, что ингибиторы ацетилирования (ИА) способны индуцировать дифференцировку трансформированных клеток мыши и тормозить клеточный цикл линий рака молочной железы. Некоторые препараты этой группы в настоящее время проходят I фазу клинических испытаний (17). Разработанный компанией “МираксБиоФарма” препарат Индигал®, содержащий ингибиторы ДНК-метилтрансферазы, также может влиять на дифференцировку опухолевых клеток через механизмы эпигенетической регуляции (1).
 
 
Список литературы к Главе 7
 
  1. Киселев В.И., Муйжнек Е.Л. (2007) Общие принципы профилактики метастатической болезни и сенсибилизации опухолей, монография, Изд-во «Димитрейд График Групп», 67-76;
  2. Bradley A., Mediana D. (1998) Introduction: BRCA1 and BRCA2 in mammary gland development and tumorogenesis, J Mammary gland Biol Neoplasia, 3(4), 363-364;
  3. Brugarolas J., Chandrasekaran C., Gordon J.I. et al. (1995) Radiation-induced cell cycle arrest compromised by 21 deficiency. Nature, 377(6549), 552-557;
  4. Clayton H., Titley I., Vivanco M. (2004) Growth and differentiation of progenitor/stem cells derived from the human mammary gland, Exp Cell Res, 297, 444–460;
  5. Crowe D.L., Lee M.K. (2006) New role for nuclear hormone receptors and coactivators in regulation of BRCA1-mediated DNA repair in breast cancer cell lines. Breast Cancer Res., 8, R1;
  6. Dontu G., Abdallah W.M., Foley J.M. et al. (2003) In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cell,  Genes Dev, 17, 1253–1270;
  7. Dontu G., El-Ashry D., Wicha M.S. (2004) Breast cancer, stem/progenitor cells and the estrogen receptor, Trends Endocrinol Metab, 15, 193–197;
  8. Fan S., Meng Q., Auborn K. et al. (2006) BRCA1 and BRCA2 as molecular targets for phytochemicals indole-3-carbinol and genistein in breast and prostate cancer cells. Br J Cancer, 94(3), 407-426;
  9. Fan S., Wang J., Yuan R. et al. (1999) BRCA1 inhibition of estrogen receptor signaling in transfected cells. Science, 284, 1354-1356;
  10. Fan S., Wang J.A., Yuan R. et al. (1998) BRCA1 as a potential human prostate tumor suppressor: modulation of proliferation, damage responses and expression of cell regulatory proteins. Oncogene, 16, 3069-3082;
  11. Foulkes W.D. (2004) BRCA1 functions as a breast stem cell regulator, J Med Genet, 41, 1–5;
  12. Kraus W.L., McInemey E.M., Katzenellenbogen B.S. (1995) Ligand-dependent, transcriptionally producative association of the amino- and carboxyl-terminal regions of a steroid hormone nuclear receptor, Proc Nat Acad Sci USA, 92, 12314-12318;
  13. Kriwacki R.W., Hengst L., Tennant L. (1996) Structural studies of p21 Waf1/Cip1/Sdi1 in the free and Cdk2-bound state: conformational disorder mediates binding diversity, 93(21), 11504-11509;
  14. Kumar V., Green S., Stack G. (1987) Functional domains of the human estrogen receptor, Cell, 51, 941-951;
  15. Langston A.A., Stanford J.L., Wicklund K.G. et al. (1996) Germ-line BRCA1 mutations in selected men with prostate cancer. Am J Hum Genet, 58(4), 881-884;
  16. Liu S., Ginestier C., Charafe-Jauffert E. et al. (2008) BRCA1 regulate human mammary stem/progenitor cell,  Proc Nat Acad Sci, 105(5), 1680-1685;
  17. Massard С., Deutsch E., Soria J.C. (2006) Tumor stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation, Annals of Oncology, 17 (11),  1620-1624;
  18. Meng Q., Qi M., Chen D.-Z. et al. (2000) Supression of breast cancer invasion and migration by indole-3-carbinol: associated with up-regulation of BRCA1 and E-cadherin/catenin complexes. J Mol Med, 78, 155-165; 
  19. Narod S.A., Foulkes W.D. (2004) BRCA1 and BRCA2:1994 and beyond, Nat Rev Cancer, 4, 665–676;
  20. Ohno R., Asou N., Ohnishi K. (2003) Treatment of acute promyelocytic leukemia: strategy toward further increase of cure rate. Leukemia, 17, 1454–1463;
  21. Park J.J., Irvine R.A., Buchnan G. et al (2000) Breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1) is a coactivator of the androgen reсeptor, Cancer Research, 60, 5946-5949;
  22. Rauh-Adelmann C., Lau K.M., Sabeti N. et al. (2000) Altered expression of BRCA1, BRCA2, and a newly identified BRCA2 exon 12 deletion variant in malignant human ovarian, prostate, and breast cancer cell lines. Mol Carcinog, 28(4), 236-246;
  23. Rosen E.M., Fan S., Goldberg I.D. (2001) BRCA1 and prostate cancer. Cancer Invest, 19(4), 396-412;
  24. Scully R. (2000) Role of BRCA gene dysfunction in breast and ovarian cancer predisposition. Breast Cancer Res, 2, 324-330;
  25. Seery L.T., Knowlden J.M., Gee J.M. et al. (1999) BRCA1 expression levels predict distant metastasis of sporadic breast cancers. Int J Cancer, 84, 258-262;
  26. Sell S. (2004) Stem cell origin of cancer and differentiation therapy. Crit Rev Oncol Hematol, 51, 1–28;
  27. Shackleton M., Vaillant F., Simpson K.J. et al. (2006) Generation of functional mammary gland from a single stem cell,  Nature, 439, 84–88;
  28. Sinlair C.S., Berry R., Schaid D. et al. (2000) BRCA1 and BRCA2 have a limited role in familial prostate cancer. Cancer Res, 60, 1371-1375;
  29. Soria J.C., Kim E.S., Fayette J. et al. (2003) Chemoprevention of lung cancer. Lancet Oncol, 4, 659–669;
  30. Taddei A., Roche D., Bickmore W.A., Almouzni G. (2005) The effects of histone deacetylase inhibitors on heterochromatin: implications for anticancer therapy? EMBO Rep, 6, 520–524;
  31. Thompson M.E., Jensen R.A., Obermiller P.S. et al. (1995) Decreased expression of BRCA1 accelerates growth and is often present during sporadic breast cancer progression. Nat Genet, 9, 444-450;
  32. Turner N.C., Reis-Filho J.S. (2006)Basal-like breast cancer and the BRCA1 phenotype, Oncogene, 25, 5846–5853;
  33. Xu X., Wagner K.U., Larson D. et al. (1999) Conditional mutation of BRCA1 in mammary epithelial cells results in blunted ductul morphogenesis and tumour formation, Nat Genet, 22, 37–43;
  34. Yeh S., Hu Y.C., Rahman M. et al. (2000) Increase of androgen-induced cell death and androgen receptor transactivation by BRCA1 in prostate cancer cells, PNAS, 97(21), 11256–11261. 

БАД НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ. Имеются противопоказания. Перед применением проконсультруйтесь со специалистом
+7 (495) 721-20-58
Консультация по телефону
АО «ИЛЬМИКСГРУПП»
2017 ИНДИГАЛ.ru