Глава 9

 

 

Рак простаты (РП) - чрезвычайно емкая и многогранная проблема, в изучение которой вовлечены специалисты разных профилей, в том числе молекулярные биологи и генетики, которые задают самый важный, по их мнению, вопрос: “Как зарождается и прогрессирует данное опухолевое заболевание?” Дело в том, что предраковые изменения в предстательной железе (простатическая интраэпителиальная неоплазия, PIN) наблюдаются в сравнительно молодом возрасте, тогда как аденокарцинома простаты развивается преимущественно в возрасте 60 лет и старше (135). При этом PIN обнаруживается у каждого третьего мужчины, а диагноз “аденокарцинома” ставится у одного из девяти. Таким образом, налицо возрастная зависимость в прогрессии данного опухолевого заболевания.
Общепризнана точка зрения, что PIN третьей стадии (PIN III) является облигатным предраковым состоянием. В пользу этого утверждения приводятся следующие факты:
1.       PIN III, как правило, обнаруживается в периферической зоне предстательной железы, т.е. там, где развивается аденокарцинома (7);
2.      появление PIN III предшествует развитию аденокарциномы;
3.      хромосомные аномалии, выявляемые при PIN III, имеют много общего с тем, что обнаруживается при генетическом анализе ранней аденокарциномы (57);
4.      нарушения в экспрессии маркеров клеточной дифференцировки при PIN III и РП идентичны.
Однако при значительном сходстве этих двух патологических состояний у них имеются и принципиальные различия. Во-первых, при PIN III базальная мембрана остается интактной. А во-вторых, при PIN, как правило, еще не регистрируется повышенный уровень сывороточного простат-специфического антигена PSA. Данный опухолевый маркер может быть обнаружен только при гистологическом исследовании. Интересно отметить, что гистологически PIN имеет выраженное сходство с предраковыми изменениями, выявляемыми в молочной железе (153).  
Возникает вопрос: каков же характер изменений в эпителиальных клетках простаты, которые делают неизбежной прогрессию PIN в аденокарциному? Совокупность накопленных к настоящему моменту экспериментальных фактов свидетельствует о том, что это, скорее всего, не функциональные нарушения, а глубокие генетические изменения, имеющие необратимый характер. Важно понимать, что какова бы ни была природа генетических аномалий, мы не располагаем возможностями их прямого “исправления”. Однако биологические последствия таких нарушений могут поддаваться лекарственной коррекции.
 
Генетические нарушения как фактор инициации канцерогенеза при раке простаты
Экспериментально установлено, что одно из значимых и распространенных явлений в раннем канцерогенезе простаты – это делеция специфической области в хромосоме 8р, которая встречается примерно в 80% случаев РП (18). При раке простаты делеции наблюдаются преимущественно в двух областях: 8р12-21 и 8р22. Причем утрата локуса 8р12-21 - более раннее событие, поскольку наблюдается и при PIN, тогда как делеция 8р22 наблюдается в основном на поздних стадиях РП. В локусе 8р12-21 картирована группа генов, обозначенных как NKX3.1. В экспериментах in vivo на животных моделях показано, что делеция аллеля NKX3.1 достаточна для развития морфологических признаков PIN. Вполне вероятно, что эта часть генома человека содержит какие-то гены-супрессоры опухолевого роста, утрата которых инициирует процессы канцерогенеза (рис. 14)
Другая распространенная генетическая аномалия, встречающаяся в 50-80% случаев РП, - это делеция в области хромосомы 10q (17). Среди генов, расположенных в этом локусе, следует отметить ген PTEN, который уже не раз упоминался и еще будет упоминаться (см. гл. 1 ч. II) в нашем обзоре (рис. 14). Участие данного гена в канцерогенезе описано для различных онкологических заболеваний, включая глиобластому, рак груди и рак эндометрия (32). Показано, что нарушение функции гена PTEN приводит к активации Аkt-зависимых сигнальных каскадов, нарушению апоптоза и клеточной пролиферации (151). Имеется достаточно данных, подтверждающих патогенетическую роль гена PTEN в канцерогенезе рака простаты (165).
Потеря хромосомы 13q, кодирующей белок ретинобластомы (pRb) – еще один супрессор опухолевого роста - наблюдается примерно в 50% случаев РП (26) (рис. 14). Известно, что роль белка pRb состоит в ограничении клеточного деления в поздней фазе G1 клеточного цикла в ответ на сигналы, ингибирующие пролиферацию. Этот белок участвует в регуляции клеточного деления через систему циклин-зависимых киназ (CDK) и их ингибиторов (98). Однако эта важная регуляторная функция может быть утрачена вследствие амплификации и гиперэкспрессии генов CDK, а также мутации в гене pRb, что приводит к нарушению сложившегося гомеостаза и малигнизации клеток (8, 30, 96).
Опухоль-супрессорные белки семейства рRb(Rb/p110, Rb/107, Rb2/p130) фосфорилируются циклин-зависимыми киназами, после чего становятся неспособными связывать ядерный фактор транскрипции E2F. Свободный фактор E2F в ответ на митогенный сигнал индуцирирует транскрипцию генов, контролирующих прогрессию клеточного цикла. И, наоборот, гипофосфорилированный рRb и связанные с ним белки секвестрируют фактор E2F и, как следствие, ингибируют клеточную пролиферацию. Показано, что белки данного семейства инактивированы вследствие мутаций в большинстве опухолей, включая рак предстательной железы (19, 118, 146). Роль белков pRb в инициации опухолевого роста однозначно доказана на мышах, дефектных по гену pRb. Гетерозиготы по гену pRb проявляли повышенную склонность к развитию опухолей предстательной железы и других органов (67, 166).
Известно, что в нормальном эпителии простаты отмечается довольно низкий уровень пролиферации, который компенсируется умеренным уровнем апоптоза (6). Напротив, при PIN и начальных стадиях канцерогенеза наблюдается почти 10-кратное увеличение пролиферативной клеточной активности, а при метастатическом раке - почти на 60% снижен апоптоз. Вероятно, нарушение регуляции клеточного цикла имеет значение на начальных стадиях процесса канцерогенеза. Среди генов, контролирующих клеточное деление и подвергающихся генетическим аномалиям при РП, следует выделить ген циклин-зависимой киназы CDK4, а также гены, кодирующие ингибиторы циклин-зависимых киназ – белки р16 и p27.Показано, что утрата функций вследствие делеций и мутаций генов р16 (14, 82) и р27 (101) часто встречается при РП. Ген, кодирующий белок р27, картирован в локусе 12р12-13.1, и делеция этого фрагмента часто обнаруживается при данном опухолевом заболевании (78) (рис. 14). В нескольких работах установлено, что уровень экспрессии р27 коррелирует со стадиями развития РП (31, 56). Прямые доказательства важности экспрессии этого белка были получены в экспериментах на животных с нарушенной структурой гена р27, у которых наблюдались гиперпластические процессы в различных органах, включая предстательную железу (41, 110).
Таким образом, все генетические аномалии, наблюдающиеся при канцерогенезе простаты можно условно разделить на две группы. Приведенные выше генетические нарушения играют основную роль в процессах инициации канцерогенеза, тогда как для развития агрессивной опухоли необходимы дополнительные структурные нарушения генома. В этом смысле, в первую очередь, следует упомянуть мутации в гене AR, приводящие к развитию состояния опухолевой рефрактерности (этот вопрос достаточно подробно был рассмотрен в предыдущих разделах). Второй тип генетических нарушений, “закрепляющий” злокачественность РП, - это утрата хромосомы 17р, несущей ген, кодирующий белок р53 (21, 137) (рис. 14). Наконец, характерной чертой метастатического гормон-рефрактерного рака, при котором трансформированные клетки утрачивают способность к апоптозу, является гиперэкспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 (106).
 
Эпигенетическая регуляция: общие принципы и основные механизмы
Известно, что набор генов одного индивидуума содержит абсолютно идентичную информацию. Однако клетки различных органов и тканей, имея полученный по наследству одинаковый набор хромосом, в процессе развития и функционирования экспрессируют различные гены. Такое многообразие способов выражения генетической информации достигается, в том числе, с помощью эпигенетической регуляции. Частично темы эпигенетической регуляции мы уже касались в гл. 1 ч. I, когда обсуждали связь хронического воспаления, а именно его мутагенного потенциала, и канцерогенных процессов. Сейчас остановимся на этом вопросе более детально, повторив наиболее важные моменты.
Итак, эпигенетическая регуляция – это эволюционный механизм, посредством которого обеспечиваются изменения в спектре экспрессии генов, возникающие в процессе развития тканей и клеток организма и не связанные с изменениями в структуре ДНК. Замечено, что изменения в спектре экспрессирующихся генов наблюдаются также по мере старения организма и при различных патологических состояниях, что является одной из главных причин необратимости некоторых из них (в первую очередь опухолевых заболеваний).
Ключевым механизмом эпигенетической регуляции является метилирование ДНК. Оно заключается в ковалентном присоединении метильной группы по С5-положению цитозина в составе динуклеотида СрG (цитозин-фосфор-гуанозин). Динуклеотидные сочетания СрG могут быть локализованы как в регуляторных (промоторных) участках генов, так и на всем остальном протяжении молекул ДНК. Примерно 50% генов млекопитающих в составе своих промоторов содержат динуклеотид CpG. Если СрG находится в неметилированном состоянии, наблюдается активная экспрессия соответствующего гена. Присоединение метильной группы к цитозину СpG, напротив, подавляет экспрессию генов и переводит их в статус “молчащих”. Есть данные, что метилированный CpG-динуклеотид обладает большим сродством к связывающим его адапторным белкам, которые, в свою очередь, взаимодействуют с транскрипционными корепрессорами (в частности гистон-диацетилазой и Sin3A), индуцирующими конденсацию хроматина и ингибирование транскрипции (113, 127).
Метилирование цитозинов в составе пары CpG осуществляется при помощи специального фермента ДНК-метилтрансферазы (DNMT), а точнее, семейства из трех изоферментов – DNMT1, DNMT3a, DNMT3b. Показано, что в условиях in vitro и in vivo уровень экспрессии и активность DNMT1 специфично повышены при многих злокачественных опухолях (38, 107, 120, 130). Важность ДНК-метилирования в малигнизации клеток подтверждается, в частности, данными о повышенной активности всех трех ДНК-метилтрансфераз при раках мочевого пузыря, почек, кишечника (130). Повышение экспрессии DNMT1 в фибробластах мыши и человека придавало им морфологические признаки трансформированных клеток, снижало их адгезивные свойства и ускоряло клеточное деление (162, 170). На животных моделях (линия мышей с пониженной активностью DNMT1) была убедительно продемонстрирована корреляция между уровнем активности DNMT и степенью злокачественности исследуемых опухолевых тканей. Таким образом, повышенный уровень DNMT-опосредованного ДНК-метилирования однозначно связывается с повышенной опухолеобразующей (малигнизирующей) активностью клеток млекопитающих. Напротив, ингибирование DNMT (особенно изоформы DNMT1) блокирует гиперметилирование вновь синтезированных ДНК-цепей, в результате чего происходит снижение общего уровня метилирования генома и реэкспрессия “молчащих” генов (25, 129, 132). Гиперметилирование генов чаще всего наблюдается в области промоторных участков  опухоль-супрессорных генов, а также большого числа генов, контролирующих ключевые события патологической клеточной пролиферации и канцерогенеза (гормональный ответ, клеточный цикл, апоптоз, процессы клеточной инвазии и репарации поврежденной ДНК) (4, 62) (рис. 15).
В связи с этим в последнее время активно разрабатывается новое перспективное направление противоопухолевой терапии, основанное на применении специфических ингибиторов ДНК-метилтрансфераз. Первоначальные успехи, достигнутые при тестировании искусственно синтезированных ингибиторов ДНК-метилтрансфераз (аналогов нуклеозидов), все больше сменяются скептическим к ним отношением по причине высокой токсичности данных соединений и большого количества возникающих при их использовании отрицательных побочных эффектов. Поэтому в настоящее время внимание исследователей все больше сосредотачивается на получении нетоксичных и высокоэффективных природных ингибиторов ДНК-метилтрансфераз (более подробно мы поговорим об этом чуть позже). Кроме того, в настоящее время интенсивно разрабатываются и начинают внедряться в клиническую лабораторную практику высокотехнологичные диагностические и фармакодиагностические тест-системы, позволяющие определять уровень опухолеспецифического ДНК-метилирования в образцах опухолевой ткани и в биологических жидкостях больного и, таким образом, улучшать прогноз и осуществлять эффективный мониторинг лечения опухолевого заболевания. 
Однако ДНК-метилирование клеточного генома имеет и обратную сторону. Дело в том, что в нормальной клетке многие потенциальные онкогены находятся в неактивном “молчащем” состоянии именно благодаря их метилированию. Кроме того, в транскрипционно неактивном, метилированном состоянии находятся и т.н. “повторяющиеся” участки ДНК, составляющие, согласно литературным данным, до 50% от общего объема генома у млекопитающих (158).Транскрипция подобных генетических повторов опасна для жизнеспособности клетки, и поэтому их метилирование является внутриклеточным приспособительным защитным механизмом.
Недавно были опубликованы результаты исследований, в которых удалось получить специальную линию мышей с очень низкой активностью ДНК-метилтрансферазы. При этом у всех животных опытной группы отмечался повышенный уровень аномальных хромосомных аберраций и в возрасте 4-8 мес. развивалась агрессивная Т-клеточная лимфома и саркома (35, 46).
Таким образом, при канцерогенезе, как правило, отмечается двойная аномалия ДНК-метилирования. С одной стороны, повышенное “региональное” метилирование (“промоторное” гиперметилирование), а с другой – пониженное метилирование в промоторных или других, не промоторных (см. ниже), участках ДНК. При этом гиперметилирование, как правило, связывается с инактивацией генов, контролирующих противоопухолевую клеточную активность: опухоль-супрессорных генов – регуляторов клеточного цикла (p16, p14, p15), а также генов, опосредующих репарацию поврежденных участков ДНК (hMLH1, BRCA1, MGMT), апоптоз (DAPK, APAF-1), метаболизм канцерогенов (GSTP1), гормональный ответ (RARb2) и клеточную адгезию (CDH1, CDH3) (27, 36, 109).Следствием же повышения гипометилирования (и вытекающей отсюда повышенной экспрессии онкогенов, а также копированием аберрантных повторов ДНК) является повышение нестабильности генома.
Различают два типа ДНК-гипометилирования при канцерогенезе: 1) общее, или геномное, гипометилирование, выражающееся в суммарном понижении содержания в геноме 5-метилцитозина, и 2) локальное, или ген-специфическое, гипометилирование – снижение метилированного цитозина в определенных участках ДНК относительно их “нормального” уровня метилирования. Локальное гипометилирование может иметь место в промоторных участках онкогенов, а также в других, высокометилированных в норме, не промоторных участках онкогенов и аберрантных генетических повторов (33).
Впервые факт общего гипометилирования ДНК в клетках предстательной железы был установлен более 20 лет тому назад в работе (5), авторы которой обнаружили, что при доброкачественной гиперплазии простаты и метастатическом РП общее содержание 5-метил-цитозина в ДНК было значительно снижено по сравнению с неметастатическим РП. В дальнейшем другими исследователями было показано, что уровень общего гипометилирования ДНК коррелирует с клинической стадией РП (136) и его метастатическим статусом (143). Локальное ген-специфическое гипометилирование таких общеизвестных онкогенов и протоонкогенов, как ras, с-jun, с-MYCи pS2 – факт, показанный для многих видов рака (40, 42, 152, 157).
Хотя факт двойной аномалии ДНК-метилирования в опухолевых клетках давно и хорошо известен, точный механизм этих процессов остается до конца не изученным. По-прежнему нет четкого ответа на вопрос: почему в раковых клетках в присутствии повышенного уровня экспрессии и активности ДНК-метилтрансферазы хромосомная ДНК остается гипометилированной? В качестве одной из возможных причин опухолеспецифического гипометилирования называется нарушенная регуляция активности ДНК-метилтрансфераз (121, 133).
Другая причина может быть связана с тем, что в качестве сайтов связывания ДНК-метилтрансферазы могут использовать фрагменты ДНК с теми или иными аномалиями структуры (в том числе с отсутствующими нуклеотидными основаниями), а также основание урацил, причем делают это даже с большим сродством, чем со специфическими для них субстратами - полуметилированными CpG-сайтами. Считается, что данная особенность обусловлена “природным происхождением” ДНК-метилтрансфераз как ферментов ДНК-репарации. Поскольку такие же, аномальные по структуре, фрагменты ДНК присутствуют во многих пренеопластических клетках человека, есть вероятность, что именно по причине связывания с ними ДНК-метилтрансфераз отмечается пониженный уровень нормально метилированных ДНК-сайтов в предопухолевых и опухолевых клетках (69).
Мы рассмотрели способы эпигенетической регуляции, осуществляемые посредством ДНК-гипер- и гипометилирования. Однако, кроме метилирования, есть еще один важный эпигенетический механизм регуляции активности генома, в результате которого изменяется структура хроматина (комплекса генов и связанных с ними ядерных белков).
Известно, что основной структурной единицей хроматина является нуклеосома. N-концевые последовательности ядерных белков гистонов, расположенные на периферии нуклеосомного ядра, подвергаются различного рода ковалентным модификациям. Одна из них – реакция ацетилирования/деацетилирования. Прямая реакция (ацетилирование) катализируется специфическим ферментом гистон-ацетилтрансферазой, обратная (деацитилирование) – гистон-деацетилазой (HDAC). Показано, что гистон-ацетилтрансфераза, индуцируя ацетилирование гистонов, активирует нескольких факторов транскрипции, в том числе ядерные гормональные рецепторы, в результате чего облегчается доступ промоторных участков генов для последующей генной транскрипции (171). И, наоборот, фермент HDAC понижает степень ацетилирования гистонов и, как следствие, ингибирует транскрипцию генов.
Следует отметить, что два основных механизма эпигенетической регуляции – ДНК-метилирование и ацетилирование гистонов, осуществляющие независимую эпигенетическую регуляцию генной экспрессии, способны также действовать совместно, переводя хроматин в транскрипционно неактивное состояние посредством связывания метилированной ДНК со специальными белками, в частности белком MeCP2. Подобное взаимодействие, в основе которого лежит объединение HDAC-активности и промоторного метилирования, приводит к более полному выключению генной транскрипции (1).Кроме того, осуществляющий метилирование цитозинов фермент ДНК-метилтрансферазаможет напрямую регулировать активность HDAC и переводить таким образом целевые гены в статус “молчащих” (43, 129).
 
Эпигенетическая регуляция при раке простаты
Эпигенетические механизмы регуляции генов – процессы ДНК-гипер- и гипометилирования, а также модификации ядерных белков гистонов - при раке предстательной железы изучены достаточно хорошо (94).
 
ДНК-гиперметилирование
Как мы уже говорили, промоторное гиперметилирование опухоль-супрессорных генов, а также генов, контролирующих ключевые молекулярные события при злокачественной клеточной трансформации, характерно для многих видов опухолей.
? Для рака простаты, это, в первую очередь, гены, опосредующие гормональный ответ. Предстательная железа, будучи типичным гормон-зависимым органом, имеет рецепторы к мужским (андрогены) и женским (эстрогены) половым гормонам. Различные генетические аномалии (мутации, амплификации и пр.), не оказывающие влияния на экспрессию андрогеновых рецепторов (AR), но драматическим образом изменяющие чувствительность AR к лигандам (андрогенам), лежат в основе развития гормон-нечувствительного рефрактерного рака простаты. Однако известно, что приблизительно 20-30% всех андроген-независимых раков простаты вообще не экспрессируют AR. Существуют данные литературы, указывающие на то, что одна из вероятных причин данного феномена заключается в промоторном AR-гиперметилировании, результатом которого является “эпигенетическое молчание” генов AR и развитие гормональной резистентности (80, 111). Кроме того, в многочисленных исследованиях показано, что ДНК-гиперметилирование – это основной механизм, определяющий инактивацию и эстрогеновых рецепторов (ER) при раке простаты (89, 115, 140, 176, 178).
? Вторая группа генов, для которых установлен факт промоторного гиперметилирования при РП, - это гены, контролирующие клеточный цикл. Ключевыми регуляторами клеточного цикла являются циклин-зависимые киназы (CDKs), их специфические ингибиторы (CDKIs), а также белок ретинобластомы (pRb).
Надо сказать, что ген pRb вообще был первым идентифицированным опухоль-супрессорным геном, и, как мы уже отмечали, его различные генетические аномалии наблюдаются в большинстве опухолей, включая рак предстательной железы. Эпигенетическая регуляция гена pRb – обязательное событие при ретинобластомах (134, 148), однако при раке простаты это достаточно редкое явление (85). При РП инактивация гена pRb, как правило, является результатом потери его гетерозиготности или мутации (85, 86).
Однако имеются сведения о том, что белок pRb может сам непосредственно влиять на процессы ДНК-метилирования, взаимодействуя с ферментными системами, участвующими в эпигенетической регуляции генной экспрессии (102, 129). Показано, что гиперэкспрессия pRb значительно снижала взаимодействие DNMT1 с ДНК, индуцируя таким образом состояние гипометилирования (122). Недавно были получены прямые экспериментальные доказательства того, что система метилирования ДНК находится под частичным контролем со стороны белка pRb. Оказалось, что промоторы генов DNMT1 мыши и человека содержат регуляторную последовательность, специфичную для транскрипционного фактора E2F1, негативно регулируемого белком pRb. В клеточных линиях, дефектных по pRb, наблюдался высокий уровень ДНК-метилтрансферазной активности (104).
В отличие от белка pRb, активность ингибиторов циклин-зависимых киназ, подавляющих клеточный рост, при РП регулируется на эпигенетическом уровне. Так, экспериментально установлено, что при некоторых видах рака, включая рак простаты, ген CDKN2A, кодирующий белок р16 (ингибитор циклин D-зависимых киназ), инактивируется не только в результате генетических аномалий (делеции, точечные мутации), но и вследствие его гиперметилирования (14, 82, 117). Эффект супрессии гена CDKN2A, опосредованной его метилированием, был продемонстрирован как на клеточных культурах (14, 82, 117), так и в образцах биопсийного материала РП (55, 70, 76, 84, 113).
? Третью группу генов, подвергающихся промоторному гиперметилированию при раке простаты, составляют гены, контролирующие процессы клеточной инвазии и архитектоники. К ним, прежде всего, относятся гены, кодирующие белки кадгерин-катениновой системы адгезии. Известно, что снижение уровня Е-кадгерина (кодируемого геном CDH1) и других белков клеточной адгезии является прогностическим фактором при различных видах рака, включая РП (128, 131).
Было установлено, что снижение экспрессии гена CDH1 при раке простаты сопровождается его промоторным метилированием, степень которого варьировала в разных исследованиях (54, 75, 76, 93, 168). Более того, есть факты, указывающие на то, что степень промоторного гиперметилирования гена CDH1 при раке простаты может рассматриваться как один из биомаркеров опухолевой прогрессии (93).
Помимо CDH1, в данную группу входит ген, кодирующий интегральный мембранный белок CD44, участвующий в адгезии внеклеточного матрикса и передаче опосредующих адгезию внутриклеточных сигналов (81, 99, 116, 160, 161, 163, 169); ген CDH13, кодирующий Н-кадгерин (103); а также гены АРС (103), СAV1 (28), LAMA3, LAMB3 и LAMC2 (141).
? В четвертую группу генов, подвергающихся гиперметилированию при РП, входят гены, отвечающие за репарацию поврежденных участков ДНК и коррекцию генетических ошибок, возникающих в ходе репликации. Для рака простаты таких генов известно два: ген, кодирующий фермент глутатион-S-трансферазу (GSTP1) и ген О6-метилгуанидин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT). Ген GSTP1 принадлежит к суперсемейству генов глутатион-S-трансфераз, играющих важную роль в детоксикации электрофильных канцерогенов и цитотоксических веществ (61).
При РП промоторное метилирование гена GSTP1 – наиболее часто встречающаяся (70-100%) эпигенетическая альтерация (90, 136). Следует отметить, что GSTP1-метилирование с частотой 50-70% отмечается также и в образцах PIN – предопухолевого заболевания, предшествующего раку простаты (9, 71), а также в нормальных неопухолевых образцах ткани простаты, хотя и значительно реже, чем в опухолевых клетках (71, 73, 172). Появляется все больше аргументов в пользу того, что опухолеспецифическое промоторное гиперметилирование гена GSTP1 может использоваться в качестве опухолевого биомаркера при клинической диагностике РП (см. ниже).
Второй ген данной группы – MGMT – кодирует фермент метилгуанин-метилтрансферазу, удаляющий мутагенные и цитотоксические алкильные аддукты из молекул ядерной ДНК. Опухоли, в которых не экспрессируется MGMT, характеризуются повышенной частотой точечных мутаций в генах, кодирующих белки р53 и К-ras (37). Кроме того, показано, что дефицитные по MGMT опухоли отличаются более высокой чувствительностью к химиотерапевтическим алкилирующим агентам.
? В последнюю, пятую, группу генов, для которых показана возможность их промоторного гиперметилирования при РП, входят т.н. “предполагаемые” опухоль-супрессорные гены, т.е. такие гены, опухоль-супрессорные функции которых к настоящему моменту полностью не доказаны. И первый из них – это ген RASSF1A, кодирующий белок, гомологичный эффекторным белкам семейства Ras. Хотя биологические функции данного белка, как мы сказали, пока до конца не ясны, известно, что его гиперэкспрессия в опухолевых клетках приводит к остановке клеточного цикла в услових invitro(147) и к ингибированию опухолевого роста у бестимусных мышей (10). В образцах РП промоторное метилирование гена RASSF- достаточно частое событие, наблюдаемое в 54-96% случаев (76, 88, 97, 175). Установлена корреляция между степенью промоторного метилирования гена RASSF1A и стадией РП по шкале Глисона (76, 97, 103). Однако метилирование гена RASSF1A с частотой 64% отмечается также и при простатической интраэпителиальной неоплазии (PIN) (76), а иногда и в нормальных неопухолевых клетках простаты (103). Таким образом, процесс промоторного метилирования гена RASSF1 начинается уже на ранних стадиях развития РП и в дальнейшем усиливается по мере развития опухоли, а значит, ген RASSF1, наряду с другими генами, может служить потенциальным опухолевым маркером при диагностике и оценке риска развития РП.
В качестве примера других генов, входящих в данную группу, можно назвать ген KAI1, кодирующий простат-специфический опухолевый супрессор метастазирования (145); ген, кодирующий ингибин-a (ростовой фактор семейства TGFb) (142) и ген DAB2IP, кодирующий новый GTP-азный активатор, модулирующий Ras-опосредованный сигнальный каскад (20).
 
ДНК-гипометилирование
Как мы уже говорили, понижение уровня ген-специфического промоторного метилирования, следствием которого является усиленная экспрессия того или иного гена, контролирующего процесс канцерогенеза, характерно для многих видов опухолей. Для рака простаты снижение уровня промоторного метилирования показано, в частности, для гена PLAU. Установлено, что данный ген усиленно экспрессируется в опухолевых клетках РП в условиях invitroи при распространенном РП (60, 159). Ген PLAU кодирует урокиназный активатор плазминогена – мультифункциональный белок, опосредующий процессы инвазии и метастазирования при многих видах рака, включая рак простаты. Показано, что, помимо амплификации гена PLAU, способствующей двух-трех-кратному повышению числа его копий (эксперименты invitroна культуре клеток PC-3 рака простаты), значительный вклад в общее повышение экспрессии PLAU при гормон-независимом РП и, как следствие, в повышение общей туморогенности и инвазивности опухоли вносит его промоторное гипометилирование (119). Отметим, что в нормальных эпителиальных клетках простаты, а также в культуре клеток LNCaP гормон-зависимого РП промотор гена PLAU находится в метилированном состоянии, результатом чего является, наоборот, его пониженная экспрессия (119).
Два других гена, для которых было показано промоторное гипометилирование при РП, - это ген CAGE, кодирующий недавно обнаруженный опухолевый тестикулярный антиген (23) (его гипометилирование встречается приблизительно в 40% образцов РП (22)), и ген гепараназы (эндо-b-D-глюкуронидазы).
 
Ацетилирование гистонов
Второй возможный способ эпигенетической регуляции генной экспрессии заключается в модификации ядерных белков гистонов, самым распространенным типом которой является их ацетилирование.
Есть данные, что обработка опухолевых клеток простаты ингибиторами гистон-деацетилазы (HDAC), удаляющей ацетильный остаток с периферической части молекулы гистона, приводит к повышению экспрессии таких генов, как ген белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста (156), и ген карбоксипептидазы А3 (СРА3) (65). Еще два гена из данной группы – это ген CAR (coxsackie and adenovirus receptor) и ген рецептора витамина D. Ген CAR кодирует основной рецептор, связывающий аденовирусы группы С и опосредующий контакт вируса с клеточной мембраной. Показано, что при РП определяется пониженная экспрессия гена CAR, коррелирующая со степенью развития опухолевого процесса по шкале Глисона (125). Второй из вышеуказанных генов кодирует рецептор, взаимодействующий с 1,25-(ОН)2-витамином D3, в результате чего происходит остановка клеточного цикла и проявляется общий антипролиферативный эффект в различных опухолях, в том числе при РП (66, 108, 173, 177).
В заключение следует отметить, что гистоны в составе ядерного хроматина могут быть модифицированы не только в ходе процесса ацетилирования, но и в результате реакции метилирования аминокислотных остатков лизина и аргинина. Есть данные, указывающие на взаимосвязь между метилированием четвертого лизинового остатка в составе гистона Н3 и инактивацией AR-опосредованной транскрипции гена PSA (простат-специфического антигена) в культуре клеток LNCaP гормон-зависимого рака простаты (79).
 
Взаимодействие между ДНК-метилированием и ацетилированием гистонов
В экспериментах invitroпоказано, что в опухолевых клеточных линиях простатического происхождения процессы промоторного ДНК-гиперметилирования и ацетилирования гистонов могут, кооперируя друг с другом, регулировать экспрессию гена DAB2IP, отличающегося низким базальным уровнем ацетилирования гистона Н3 (20), а также гена рецептора b ретиноевой кислоты (RARB), находящегося в метилированном состоянии в большинстве простатических опухолевых клеток и тканей (112).
Таким образом, становится все более очевидно, что наиболее оптимальным способом, с помощью которого можно активировать транскрипцию ключевых опухоль-супрессорных генов и вывести их из статуса “эпигенетически молчащих”, является комплексное использование ингибиторов ферментов DNMT и HDAC, катализирующих основные процессы эпигенетической модификации. Однако нельзя упускать из внимания и другие (второстепенные по важности) эпигенетические реакции. Так, показано, что на суммарную регуляцию генной транскрипции может влиять кооперация процессов ДНК-метилирования и метилирования гистонов (44, 45, 92).
 
Эпигенетические модификации как опухолевые маркеры рака простаты
Хорошо известно, что основное требование врачей-клиницистов, предъявляемое к идеальному опухолевому маркеру (помимо высокой специфичности и чувствительности) - это легкость его детекции в клиническом материале, полученном максимально неинвазивным способом. С этой точки зрения, количественно определенный в клиническом образце уровень ДНК-гиперметилирования, по мнению ряда исследователей (63, 123), представляется весьма перспективным биомаркером и вот почему. Во-первых, в отличие от мутаций, процесс метилирования всегда происходит в строго определенных участках ДНК (т.н. CpG-островках) и может быть обнаружен при использовании высокочувствительного и доступного метода ПЦР (64) или обладающего высокой разрешающей способностью метода бисульфитного геномного секвенирования (24). Второй важный момент заключается в том, что ДНК-гиперметилирование встречается практически во всех видах злокачественных опухолей, при этом каждый вид рака имеет свою, характерную только для него, картину ключевых метилированных генов, например, ген Hippel-Lindau - для рака почки (2), ген MLH1 - для рака прямой кишки (126), ген АРС – для рака пищевода (77) и др. Наконец, третье важное обстоятельство – это то, что процессы ДНК-метилирования могут протекать на ранних стадиях канцерогенеза (63).
При РП наиболее часто подвергается гиперметилированию подробно обсуждавшийся нами выше ген GSTP1 (91, 136). В литературе описаны многочисленные попытки использования в качестве онкомаркера уровня метилирования гена GSTP1 (количества метилированных CpG-динуклеотидов), определенного у больных РП в различном клиническом материале: в сыворотке и плазме крови (48, 72), секрете простаты (52, 150), моче (13, 48, 49, 53), биопсийном материале из простаты (49, 59).
Авторам работы (49), определявшим степень ДНК-метилирования гена GSTP1 в пробах мочи у пациентов после массажа предстательной железы, удалось диагностировать рак простаты со специфичностью 98% и общей чувствительностью 73%. Другие авторы проводили сравнительное исследование общепринятого метода диагностики, основанного на гистологическом анализе взятого из простаты биопсийного материала, и показателя относительного уровня метилирования гена GSTP1 (соотношения степени метилирования гена-маркера GSTP1 и гена сравнения MYOD1) (58). Оказалось, что при использовании только гистологического метода рак простаты диагностировался с чувствительностью 64% и специфичностью 100%, в то время как применяя гистологический анализ вместе с определением GSTP1-метилирования, в большом числе случаев удавалось обнаружить РП с чувствительностью 75% и специфичностью 100%.
Есть данные, что метилирование гена GSTP1 может быть успешно использовано для обнаружения у онкобольных опухолевых простатических клеток в лимфатических узлах (83). C теми же целями, правда, с несколько меньшей специфичностью, может использоваться и ген CD44 (163).
Следует, однако, сказать, что, с точки зрения дальнейшего развития и внедрения в клиническую практику метода диагностики онкозаболеваний с помощью определения уровня ДНК-метилирования генов-маркеров, наиболее оптимальным и перспективным подходом представляется оценка степени метилирования не одного, а группы ключевых генов, контролирующих процессы канцерогенеза. В этом случае успешно преодолеваются возможные ограничения, имеющие место при анализе единичного гена (недостаточная чувствительность; низкая специфичность; невозможность дифференцировки РП от доброкачественных новообразований и опухолей, имеющих другое органное происхождение; невозможность оценки риска развития опухолевого заболевания).
В нескольких независимых исследованиях удалось доказать эффективность подобного диагностического подхода при раке простаты (76, 175). Авторы этих исследований, анализируя уровень метилирования генов GSTP1, APC, RASSF1 и MDR1 в клинических образцах, смогли с чувствительностью 97-100% и специфичностью 92-100% отличить первичный рак простаты от доброкачественных тканей предстательной железы (175). Можно ожидать, что в будущем (с учетом темпов развития молекулярно-биологических методов диагностики) в клинической практике данный подход найдет свое воплощение в создании соответствующих тестов-микрочипов, предназначенных для анализа степени метилирования 5-10 наиболее репрезентативных при РП генов.
Следует упомянуть о том, что оценка состояния ДНК-метилирования (это следует из данных литературы) может оказаться полезной не только для диагностики рака простаты, но и для его молекулярной классификации. Распространенная сегодня классификация РП, в основе которой лежат гистопатологические наблюдения, не в состоянии ответить на вопросы о том, разовьется ли протекающий в латентной форме РП в клинически выраженную форму и будет ли чувствительна развившаяся опухоль к последующей андрогенной аблации. В то же время при использовании дополнительных данных об уровне ДНК-метилирования ключевых генов в большинстве случаев удается предсказать дальнейшее “поведение” опухоли (59).
 
Эпигенетические модуляторы в терапии рака простаты
Обращение ДНК-гиперметилирования ингибиторами ДНК метилтрансферазы
Как мы уже отмечали, в отличие от мутаций, необратимо меняющих структуру генов, эпигенетические модификации, в частности процессы ДНК-метилирования, являются потенциально обратимыми. Данное свойство делает их чрезвычайно привлекательной мишенью для таргетной противоопухолевой терапии (3).
Из всего вышеизложенного с очевидностью следует, что один из вероятных механизмов инициации канцерогенеза простаты состоит в активации системы промоторного метилирования ДНК. И, следовательно, одно из важных направлений профилактики рака простаты - это вмешательство в процессы ДНК-метилирования. Доказательством справедливости такого утверждения являются данные, полученные в экспериментах in vitro, а также на мышиной модели рака простаты.
В настоящее время ингибиторы ДНК-метилтрансферазы - 5-аза-цитидин и 5-аза-дезоксицитидин (децитабин), представляющие собой нуклеозидные аналоги, широко используются в исследованиях in vitro и in vivo для обращения аномального ДНК-гиперметилирования и реактивации “молчащих” (транскрипционно неактивных) генов. Авторы работы (105) исследовали влияние ингибитора ДНК-метилтрансферазы - 5-аза-2-дезоксицитидина на развитие спонтанных опухолей у мышей. Оказалось, что ингибирование DNMT подавляло развитие опухолей, предотвращало появление метастазов в лимфатических узлах и существенно увеличивало продолжительность жизни экспериментальных животных. Однако в условиях клиники применение этих ингибиторов дало весьма ограниченный терапевтический эффект (51, 155). Кроме того, данные соединения вызывали такие серьезные побочные эффекты как миелотоксичность (74), мутагенность (68) и туморогенность (164).
Все это побуждает исследователей к созданию менее токсичных синтетических ингибиторов DNMT, не являющихся нуклеозидными аналогами (95, 100, 144), а также к поиску новых нетоксичных и высокоэффективных ингибиторов ДНК-метилтрансфераз среди соединений природного происхождения. Тем более что в ходе многочисленных экспериментальных и клинических исследований, проведенных в последние годы, выяснилось, что многие компоненты повседневного питания – алкоголь, некоторые микроэлементы, металлы и витамины - являются факторами регуляции процессов ДНК-метилирования (29).
Многолетние наблюдения эпидемиологов показали, что традиционные привычки в питании вносят значительный вклад в показатели смертности от опухолей в различных странах. Статистические данные достоверно свидетельствуют о том, что в тех регионах земного шара, где традиционным считается употребление морепродуктов, сырых овощей, фруктов, зеленого чая (Юго-Восточная Азия, страны Средиземноморья), уровни онкологической заболеваемости гораздо ниже, чем в Европе и Америке. Современные технологии приготовления пищи, стремление к увеличению ее сроков годности, добавление консервантов и искусственных красителей, различных стабилизаторов и усилителей вкуса оказывают отрицательное влияние на здоровье человека. Изучение заболеваемости эмигрантов также подтверждает эти выводы: смена традиционной диеты влечет за собой развитие тех же заболеваний, которыми страдает местное население.
Не вызывает сомнения, что характер питания влияет на огромное количество процессов, происходящих в организме. Сегодня стало очевидно, что это влияние распространяется и на субмолекулярном уровне. Оно заключается в изменении характера метилирования и, как следствие, уровня экспрессии хромосомных генов, ответственных за клеточную выживаемость и онкопротекторные свойства.
В 2003 г. была опубликована сенсационная статья, авторы которой показали, что флавоноид эпигаллокатехин-3-галлат является эффективным ингибитором фермента ДНК-метилтрансферазы (39). На различных линиях опухолевых клеток человека было установлено, что EGCG (5-50 мкМ) дозо-зависимым образом эффективно подавлял активность ДНК-метилтрансферазы, в результате чего происходило деметилирование CpG-динуклеотидов и реактивация метилированных “молчащих” (транскрипционно неактивных) генов, вовлеченных в процессы канцерогенеза, а именно, гена супрессора опухолевого роста р16, гена ретиноидных рецепторов (RAR), гена метилгуанин-метилтрансферазы (MGMT) и гена hMLH1, ответственного за репарацию ДНК (рис. 15).
Двумя годами позже другие авторы описали молекулярный механизм этого процесса (91). Оказалось, что в отличие от других катехинов зеленого чая, EGCG-опосредованное ингибирование ДНК-метилтрансферазы, осуществляемое по неконкурентному механизму, происходило независимо от процесса метилирования самого катехина (известно, что промежуточные метилированные продукты полифенолов сами по себе могут быть ингибиторами процесса ДНК-метилирования), а исключительно благодаря прямому взаимодействию фермента с EGCG. При этом данный процесс на порядок усиливался в присутствии миллимолярных концентраций катиона Mg2+ (рис. 16).
Такая же концентрация EGCG в тканях и, следовательно, те же биологические эффекты, связанные с ингибированием ДНК-метилтрансферазы, достигаются при приеме терапевтических доз препарата Индигал®, разработанного отечественной фармацевтической компанией “МираксБиоФарма”. Таким образом, в нашем распоряжении имеется поистине уникальный биопрепарат, способный не только подавлять рост и стимулировать гибель опухолевых клеток, но и восстанавливать на субмолекулярном (генетическом) уровне собственную противоопухолевую защиту организма.
 
Обращение ДНК-гипометилирования путем супрессии гиперэкспрессирующихся генов
Основным подходом, применяемым для обращения пониженного метилирования генов (онкогенов и ДНК-повторов), т.е. их повышенной экспрессии, в настоящее время считается применение синтетических смысловых олигонуклеотидов, в которых остаток цитозина замещен на 5’-метилцитозин (174, 178). При связывании метилированных олигонуклеотидов с одной из цепей ДНК образуется полуметилированный промежуточный продукт, имеющий структуру наподобие “репликационной вилки” и являющийся предпочтительным субстратом для ДНК-метилтрансферазы. В дальнейшем DNMT метилирует данный ген и во второй цепочке ДНК, а также в других целевых участках генома (174).
В настоящее время данный способ эпигенетической коррекции успешно разрабатывается в экспериментах in vitro (подавление гиперэкспрессии гена ESR2) (89) и in vivo (супрессия гена инсулиноподобного фактора роста 2) (174). Однако до внедрения его в клиническую практику пока еще далеко.
 
Реактивация транскрипционно “молчащих” генов ингибиторами гистон-деацетилазы
Напомним, что в функции фермента HDAC входит удаление ацетильной группы, связанной с N-концевым лизиновым остатком гистона, в результате чего хроматин поддерживается в транскрипционно неактивном состоянии. Эта транскрипционная блокада может быть преодолена с помощью агентов, являющихся ингибиторами HDAC. К их числу принадлежат вещества различной природы, многие из которых имеют природное происхождение. Это TSA (149), бутират натрия (149), депсипептид (FR901228 и FK228) (139), вальпроевая кислота (154), MS-275 (16), пироксамид (12), фенилбутират (34) и ряд других. Некоторые из них (депсипептид) сейчас проходят клинические испытания.
Все HDAC-ингибиторы, протестированные в условиях in vitro на культурах опухолевых клеток РП, продемонстрировали выраженный антипролиферативный эффект (12, 34), однако лежащие в его основе молекулярные механизмы носили различный характер. Так, например, бутират натрия и TSA синергично с 1,25-(ОН)2-витамином D3 подавляли рост клеток РП независимо от их гормонального статуса (линии LNCAP, PC-3, DU145), вызывая их апоптоз (124). Вальпроевая кислота также индуцировала апоптотическую гибель простатических опухолевых клеток, повышая экспрессию некоторых проапоптотических генов (154). Cреди других биологических процессов ингибирования опухолевого роста под действием HDAC-ингибиторов называется повышение экспрессии опухоль-супрессорных генов (CDKN1A), контролирующих клеточный цикл (12, 138), понижение теломеразной активности (149), ингибирование ангиогенных факторов (фактора VEGF) и основного фактора роста фибробластов (139). При этом, как правило, в присутствии HDAC-ингибиторов происходил описанный нами выше процесс деацетилирования гистонов и, как следствие, активировалась генная транскрипция. Однако в некоторых случаях HDAC-ингибиторы снижали экспрессию гиперацетилированных генов (139, 149). В частности, в присутствии HDAC-ингибитора депсипептида отмечалось торможение роста простатических опухолевых клеток линии PC-3, сопровождавшееся подавлением экспрессии (снижением уровня) мРНК сосудистого фактора роста VEGF, хотя при этом отмечалось накопление ацетилированных гистонов хроматина в промоторной зоне гена VEGF (139). Почему именно происходит это накопление – пока остается неясным. В литературе описаны также примеры успешного использования HDAC-ингибиторов (SAHA, депсипептида, бутирата натрия, трибутирина) в качестве противоопухолевых средств на ксенотрансплантатных животных моделях рака простаты в условиях in vivo (11, 12, 87, 139).
Подводя итог всему вышесказанному, отметим, что экспериментальный подход, основанный на эпигенетической регуляции экспрессии генов, опосредующих противоопухолевую клеточную активность, в настоящее время постепенно преобразуется в новое современное направление противоопухолевой таргетной терапии вообще и рака простаты в частности. Можно ожидать, что будущее этого направления главным образом будет связано с применением нетоксичных и безопасных ингибиторов ДНК-метилирования и гистонового деацитилирования (возможно, используемых совместно, с учетом данных об их аддитивном и синергичном действии) (15, 47, 167). Крайне важным моментом является также развитие основанных на эпигенетической генной модификации новых методов предклинической и клинической онкодиагностики.
 
 
           Список литературы к Главе 9
 
 
1.      Antequera F., Bird A. (1999) CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. Curr Biol,  9, R661–R667;
2.      Battagli C., Uzzo R.G., Dulaimi E. et al. (2003) Promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in urine from kidney cancer patients. Cancer Res, 63, 8695–8699;
3.      Baylin S.B., Belinsky S.A., Herman J.G. (2000) Aberrant methylation of gene promoters in cancer - concepts, misconcepts, and promise. J Natl Cancer Inst, 92, 1460–1461;
4.      Baylin S.B., Herman J.G. (2000) DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics, Trends Genet, 16, 168–174;
5.      Bedford M.T., van Helden P.D. (1987) Hypomethylation of DNA in pathological conditions of the human prostate. Cancer Res, 47, 5274–5276;
6.      Berges R.R., Vukanovic J., Epstein J.I. et al. (1995). Implication of cell kinetic changes during the progression of human prostatic cancer. Clin Cancer Res, 1, 473-480;
7.      Bostwick D.G., Brawer M.K. (1987) Prostatic intra-epithelial neoplasia and early invasion in prostate cancer. Cancer, 59, 788-794;
8.      Bringold F., Serrano M. (2000) Tumor suppressors and oncogenes in cellular senescence, Exp Gerontol, 35, 317–329;
9.      Brooks J.D., Weinstein M., Lin X. et al. (1998) CG island methylation changes near the GSTP1 gene in prostatic intraepithelial neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 7, 531–536;
10. Burbee D.G., Forgacs E., Zochbauer-Muller S. et al. (2001) Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression. J Natl Cancer Inst, 93, 691–699;
11. Butler L.M., Agus D.B., Scher H.I. et al. (2000) Suberoylanilide hydroxamic acid, an inhibitor of histone deacetylase, suppresses the growth of prostate cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Res, 60, 5165–5170;
12. Butler L.M., Webb Y., Agus D.B. et al. (2001) Inhibition of transformed cell growth and induction of cellular differentiation by pyroxamide, an inhibitor of histone deacetylase. Clin Cancer Res, 7, 962–970;
13. Cairns P., Esteller M., Herman J.G. et al. (2001) Molecular detection of prostate cancer in urine by GSTP1 hypermethylation. Clin Cancer Res, 7, 2727–2730;
14. Cairns P., Polascik T.J., Eby Y. et al. (1995) Frequency of homozygous deletion at p16/CDKN2 in primary human tumours. Nat Genet, 11, 210–212;
15. Cameron E.E., Bachman K.E., Myohanen S. et al. (1999) Synergy of demethylation] and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat Genet, 21, 103–107;
16. Camphausen K., Burgan W., Cerra M. et al. (2004) Enhanced radiation-induced cell killing and prolongation of gammaH2AX foci expression by the histone deacetylase inhibitor MS-275. Cancer Res, 64, 316–321;
17. Carter B.S., Ewing C.M., Ward W.S. et al. (1990) Allelic loss of chromosomes 16q and 10q in human prostate cancer. Proc Natl Acad Sci, 87, 8751-8755;
18. Chang M., Tsuchiya K., Batchelor R.H. et al. (1994) Deletion mapping of chromosome 8p in colorectal carcinoma and dysplasia arising in ulcerative colitis, prostatic carcinoma, and malignant fibrous histiocytomas. Am J Pathol, 144, 1-6;
19. Chau B.N., Wang J.Y. (2003) Coordinated regulation of life and death by RB. Nature Reviews Cancer, 3, 130–138;
20. Chen H., Toyooka S., Gazdar A.F., Hsieh J.T. (2003) Epigenetic regulation of a novel tumor suppressor gene (hDAB2IP) in prostate cancer cell lines. J Biol Chem, 278, 3121–3130;
21. Cher M.L., Bova G.S., Moore D.H. et al.  (1996) Genetic alterations in untreated metastases and androgen-independent prostate cancer detected by comparative genomic hybridization and allelotyping. Cancer Res, 56, 3091-3102;
22. Cho B., Lee H., Jeong S. et al. (2003) Promoter hypomethylation of a novel cancer/testis antigen gene CAGE is correlated with its aberrant expression and is seen in premalignant stage of gastric carcinoma. Biochem Biophys Res Commun, 307, 52–63;
23. Cho B., Lim Y., Lee D.Y. et al. (2002) Identification and characterization of a novel cancer/testis antigen gene CAGE. Biochem Biophys Res Commun, 292, 715–726;
24. Clark S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. (1994) High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res, 22, 2990–2997;
25. Clark S.J., Melki J. (2002) DNA methylation and gene silencing in cancer: which is the guilty party. Oncogene, 21, 5380-5387;
26. Cooney K.A., Wetzel J.C., Merajver S.D. et al.  (1996) Distinct regions of allelic loss on 13q in prostate cancer. Cancer Res, 56, 1142-1145;
27. Costello J.F., Plass C. (2001) Methylation matters. J Med Genet, 38, 285–303;
28. Cui J., Rohr L.R., Swanson G. et al. (2001) Hypermethylation of the caveolin-1 gene promoter in prostate cancer. Prostate, 46, 249–256;
29. Davis C.D., Uthus E.O. (2004) DNA Methylation, Cancer Sussceptibility, and Nutrient Interactions. Experimental biology and medicine, 229, 988-995;
30. Day M.L., Foster R.G., Day K.C. et al. (1997) Cell anchorage regulates apoptosis through the retinoblastoma tumor suppressor/E2F pathway. J Biol Chem  272, 8125–8128;
31. De Marzo A.M., Meeker A.K., Epstein J.I., Coffey D.S. (1998) Prostate stem cell compartments: Expression of the cell cycle inhibitor p27Kip1 in normal, hyperplastic, and neoplastic cells. Am J Pathol, 153, 911-919;
32. Di Cristofano A., Pandolfi P.P. (2000) The multiple roles of PTEN in tumor suppression. Cell 100, 387-390;
33. Dunn B.K. (2003) Hypomethylation: one side of a larger picture. Ann N Y Acad Sci,  983, 28–42;
34. Dyer E.S., Paulsen M.T., Markwart S.M. et al. (2002) Phenylbutyrate inhibits the invasive properties of prostate and breast cancer cell lines in the sea urchin embryo basement membrane invasion assay. Int J Cancer, 101, 496–499;
35. Eden A., Gaudet F., Waghmare A., Jaenisch R. (2003) Chromosomal instability and tumors promoted by DNA hypomethylation. Science (Wash. DC), 300, 455;
36. Esteller M. (2002) CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future. Oncogene, 21, 5427–5440;
37. Esteller M., Herman J.G. (2004) Generating mutations but providing chemosensitivity: the role of O6-methylguanine DNA methyltransferase in human cancer. Oncogene 23, 1–8;
38. Fang J.Y., Cheng Z.H., Chen Y.X. et al. (2004) Expression of Dnmt1, demethylase, MeCP2 and methylation of tumor-related genes in human gastric cancer. World J Gastroenterol, 10, 3394-3398;
39. Fang M.Z., Wang Y., Ai N. et al. (2003) Tea Polyphenol (-)-Epigallocatechin-3-Gallate Inhibits DNA Methyltransferase and Reactivates Methylation-Silenced Genes in Cancer Cell Lines. Cancer Res, 63, 7563-7570;
40. Feinberg A.P., Vogelstein B. (1983) Hypomethylation of ras oncogenes in primary human cancers. Biochem Biophys Res Commun, 111, 47–54;
41. Fero M.L., Rivkin M., Tasch M. et al. (1996) A syndrome of multiorgan hyperplasia with features of gigantism, tumorigenesis, and female sterility in p27(Kip1)-deficient mice. Cell, 85, 733-744;
42. Fruhwald M.C., Plass C. (2002) Global and gene-specific methylation patterns in cancer: aspects of tumor biology and clinical potential. Mol Genet Metab, 75, 1–16;
43. Fuks F., Burgers W.A., Godin N. et al. (2001) Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription. Embo J, 20, 2536–2544;
44. Fuks F., Hurd P.J., Deplus R., Kouzarides T. (2003) The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res, 31, 2305–2312;
45. Fuks F., Hurd P.J., Wolf D. et al. (2003) The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J Biol Chem, 278, 4035–4040;
46. Gaudet F., Hodgson J.G., Eden A. et al. (2003) Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation. Science (Wash. DC), 300, 489-492;
47. Ghoshal K., Datta J., Majumder S. et al. (2002) Inhibitors of histone deacetylase and DNA methyltransferase synergistically activate the methylated metallothionein I promoter by activating the transcription factor MTF-1 and forming an open chromatin structure. Mol Cell Biol, 22, 8302–8319;
48. Goessl C., Krause H., Muller M. et al. (2000) Fluorescent methylation-specific polymerase chain reaction for DNA- based detection of prostate cancer in bodily fluids. Cancer Res, 60, 5941–5945;
49. Goessl C., Muller M., Heicappell R. et al. (2001) DNA-based detection of prostate cancer in urine after prostatic massage. Urology, 58, 335–338;
50. Goessl C., Muller M., Heicappell R. et al. (2002) Methylation-specific PCR for detection of neoplastic DNA in biopsy washings. J Pathol, 196, 331–334;
51. Goffin J., Eisenhauer E. (2002) DNA methyltransferase inhibitors—state of the art. Ann Oncol 13, 1699–1716;
52. Gonzalgo M.L., Nakayama M., Lee S.M. et al. (2004) Detection of GSTP1 methylation in prostatic secretions using combinatorial MSP analysis. Urology, 63, 414–418;
53. Gonzalgo M.L., Pavlovich C.P., Lee S.M., Nelson W.G. (2003) Prostate cancer detection by GSTP1 methylation analysis of postbiopsy urine specimens. Clin Cancer Res, 9, 2673–2677;
54. Graff J.R., Herman J.G., Lapidus R.G. et al. (1995) E-cadherin expression is silenced by DNA hypermethylation in human breast and prostate carcinomas. Cancer Res, 55, 5195–5199;
55. Gu K., Mes-Masson A.M., Gauthier J., Saad F. (1998) Analysis of the p16 tumor suppressor gene in early-stage prostate cancer. Mol Carcinog, 21, 164–170;
56. Guo Y., Sklar G.N., Borkowski A., Kyprianou N. (1997) Loss of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1) protein in human prostate cancer correlates with tumor grade. Clin Cancer Res, 3, 2269-2274;
57. Haggman M.J., Wojno K.J., Pearsall C.P., Macoska J.A. (1997) Allelic loss of 8p sequences in prostatic intraepithelial neoplasia and carcinoma. Urology 50, 643-647;
58. Harden S.V., Guo Z., Epstein J.I., Sidransky D. (2003) Quantitative GSTP1 methylation clearly distinguishes benign prostatic tissue and limited prostate adenocarcinoma. J Urol, 169, 1138–1142;
59. Harden S.V., Sanderson H., Goodman S.N. et al. (2003) Quantitative GSTP1 methylation and the detection of prostate adenocarcinoma in sextant biopsies. J Natl Cancer Inst, 95, 1634–1637;
60. Helenius M.A., Saramaki O.R., Linja M.J. et al. (2001) Amplification of urokinase gene in prostate cancer. Cancer Res, 61, 5340–5344;
61. Henderson C.J., McLaren A.W., Moffat G.J. et al. (1998) Pi-class glutathione S-transferase: regulation and function. Chem Biol Interact, 111–112, 69–82;
62. Herman J.G.(1999) Hypermethylation of tumor suppressor genes in cancer, Semin Cancer Biol, 9, 359–367;
63. Herman J.G., Baylin S.B. (2003) Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N Engl J Med, 349, 2042–2054;
64. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., Baylin S.B. (1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 9821–9826;
65. Huang H., Reed C.P., Zhang J.S. et al. (1999) Carboxypeptidase A3 (CPA3): a novel gene highly induced by histone deacetylase inhibitors during differentiation of prostate epithelial cancer cells. Cancer Res, 59, 2981–2988;
66. Ikeda N., Uemura H., Ishiguro H. et al. (2003) Combination treatment with 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and 9-cis-retinoic acid directly inhibits human telomerase reverse transcriptase transcription in prostate cancer cells. Mol Cancer Ther, 2, 739–746;
67. Jacks T., Fazeli A., Schmitt E.M. et al (1992) Effects of an Rb mutation in the mouse, Nature 359, 295–300;
68. Jackson-Grusby L., Laird P.W., Magge S.N. et al (1997) Mutagenicity of 5-aza-2'-deoxycytidine is mediated by the mammalian DNA methyltransferase. Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 4681–4685;
69. James S.J., Pogribny I.P., Pogribna M. et al. (2003) Mechanisms of DNA damage, DNA hypomethylation, and tumor progression in the folate/methyl-deficient rat model of hepatocarcinogenesis. J Nutr, 133, 3740S-3747S;
70. Jarrard D.F., Bova G.S., Ewing C.M. et al (1997) Deletional, mutational, and methylation analyses of CDKN2 (p16/MTS1) in primary and metastatic prostate cancer. Genes Chromosomes Cancer, 19, 90–96;
71. Jeronimo C., Usadel H., Henrique R. et al. (2001) Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma. J Natl Cancer Inst, 93, 1747–1752;
72. Jeronimo C., Usadel H., Henrique R. et al. (2002) Quantitative GSTP1 hypermethylation in bodily fluids of patients with prostate cancer. Urology, 60, 1131–1135;
73. Jeronimo C., Varzim G., Henrique R. et al. (2002) I105V polymorphism and promoter methylation of the GSTP1 gene in prostate adenocarcinoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 11, 445–450;
74. Jones P.A., Taylor S.M. (1980) Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell 20, 85–93;
75. Kallakury B.V., Sheehan C.E., Winn-Deen E. et al. (2001) Decreased expression of catenins (and ), p120 CTN, and E-cadherin cell adhesion proteins and E-cadherin gene promoter methylation in prostatic adenocarcinomas. Cancer, 92, 2786–2795;
76. Kang G.H., Lee S., Lee H.J., Hwang K.S. (2004) Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. J Pathol, 202, 233–240;
77. Kawakami K., Brabender J., Lord R.V. et al. Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma. J Natl Cancer Inst, 92, 1805–1811;
78. Kibel A.S., Schutte M., Kern S.E. et al. (1998) Identification of 12p as a region of frequent deletion in advanced prostate cancer. Cancer Res, 58, 5652-5655;
79. Kim J., Jia L., Tilley W.D., Coetzee G.A. (2003) Dynamic methylation of histone H3 at lysine 4 in transcriptional regulation by the androgen receptor. Nucleic Acids Res, 31, 6741–6747;
80. Kinoshita H., Shi Y., Sandefur C. et al. (2000) Methylation of the androgen receptor minimal promoter silences transcription in human prostate cancer. Cancer Res, 60, 3623–3630;
81. Kito H., Suzuki H., Ichikawa T. et al. (2001) Hypermethylation of the CD44 gene is associated with progression and metastasis of human prostate cancer. Prostate, 49, 110–115;
82. Koh J., Enders G.H., Dynlacht B.D., Harlow E. (1995) Tumour-derived p16 alleles encoding proteins defective in cell-cycle inhibition. Nature, 375, 506–510;
83. Kollermann J., Muller M., Goessl C. et al. (2003) Methylation-specific PCR for DNA-based detection of occult tumor cells in lymph nodes of prostate cancer patients. Eur Urol, 44, 533–538;
84. Konishi N., Nakamura M., Kishi M. et al (2002) DNA hypermethylation status of multiple genes in prostate adenocarcinomas. Jpn J Cancer Res, 93, 767–773;
85. Konishi N., Nakamura M., Kishi M. et al. (2002) Heterogeneous methylation and deletion patterns of the INK4a/ARF locus within prostate carcinomas. Am J Pathol, 160, 1207–1214;
86. Kubota Y., Fujinami K., Uemura H. et al. (1995) Retinoblastoma gene mutations in primary human prostate cancer. Prostate, 27, 314–320;
87. Kuefer R., Hofer M.D., Altug V. et al. (2004) Sodium butyrate and tributyrin induce in vivo growth inhibition and apoptosis in human prostate cancer. Br J Cancer, 90, 535–541;
88. Kuzmin I., Gillespie J.W., Protopopov A. et al. (2002) The RASSF1A tumor suppressor gene is inactivated in prostate tumors and suppresses growth of prostate carcinoma cells. Cancer Res, 62, 3498–3502;
89. Lau K.M., LaSpina M., Long J., Ho S.M. (2000) Expression of estrogen receptor (ER)-and ER-in normal and malignant prostatic epithelial cells: regulation by methylation and involvement in growth regulation. Cancer Res, 60, 3175–3182;
90. Lee W.H., Isaacs W.B., Bova G.S., Nelson W.G. (1997) CG island methylation changes near the GSTP1 gene in prostatic carcinoma cells detected using the polymerase chain reaction: a new prostate cancer biomarker. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 6, 443–450;
91. Lee W.J., Shim J.-Y., Zhu B.T. (2005) Mechanisms for the Inhibition of DNA Methyltransferases by Tea Catechins and Bioflavonoids. Mol Pharmacol, 68, 1018-1030;
92. Lehnertz B., Ueda Y., Derijck A.A. et al. (2003)  Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin. Curr Biol 13, 1192–1200;
93. Li L.C., Zhao H., Nakajima K. et al. (2001) Methylation of the E-cadherin gene promoter correlates with progression of prostate cancer. J Urol 166, 705–709;
94. Li L.-Ch., Carroll P.R., Dahiya R. (2005) Epigenetic changes in prostate cancer: implication for diagnosis and treatment. J Nat Cancer Instit,  97(2), 103-115;
95. Lin X., Asgari K., Putzi M.J. et al. (2001) Reversal of GSTP1 CpG island hypermethylation and reactivation of pi-class glutathione S-transferase (GSTP1) expression in human prostate cancer cells by treatment with procainamide. Cancer Res, 61, 8611–8616;
96. Lipinski M.M., Jacks T. (1999) The retinoblastoma gene family in differentiation and development, Oncogene, 18, 7873–7882;
97. Liu L., Yoon J.H., Dammann R., Pfeifer G.P. (2002) Frequent hypermethylation of the RASSF1A gene in prostate cancer. Oncogene, 21, 6835–6840;
98. Livingston D.M., DeCaprio J.A., Ludlow J.W. (1989) Does the product of the RB-1 locus have a cell cycle regulatory function? Princess Takamatsu Symp, 20, 187–190;
99. Lou W., Krill D., Dhir R. et al. (1999) Methylation of the CD44 metastasis suppressor gene in human prostate cancer. Cancer Res, 59, 2329–2331;
100.                     Lu Q., Kaplan M., Ray D. et al (2002) Demethylation of ITGAL (CD11a) regulatory sequences in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 46, 1282–1291;
101.                     Macri E., Loda M. (1999) Role of p27 in prostate carcinogenesis. Cancer Metastasis Rev. 17, 337-344;
102.                     Magnaghi-Jaulin L., Groisman R., Naguibneva I. et al. (1998) Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature, 391, 601–605;
103.                     Maruyama R., Toyooka S., Toyooka K.O. et al. (2002) Aberrant promoter methylation profile of prostate cancers and its relationship to clinicopathological features. Clin Cancer Res, 8, 514–519;
104.                     McCabe M.T., Davis J.N., Day M.L. (2005) Regulation of DNA Methyltranferase 1 by the pRb/E2F1 pathway, Cancer Research, 65, 3624-3632;
105.                     McCabe M.T., Low J.A., Daignault S. et al. (2006) Inhibition of DNA Methyltransferase activity prevents tumorogenesis in a mouse model of prostate cancer, Cancer Research, 66, 385-392;
106.                     McDonnell T.J., Navone N.M., Troncoso P. et al. (1997) Expression of bcl-2 oncoprotein and p53 protein accumulation in bone marrow metastases of androgen independent prostate cancer. J Urol, 157, 569-574; 
107.                     Mizuno S., Chijiwa T., Okamura T. et al. (2001) Expression of DNA methyltransferases DNMT1, 3A, and 3B in nirmal hematopoiesis and in acute and chronic myelogenous leukemia. Blood, 97, 1172-1179;
108.                     Moffatt K.A, Johannes W.U., Miller G.J. (1999) 1Alpha, 25dihydroxyvitamin D3 and platinum drugs act synergistically to inhibit the growth of prostate cancer cell lines. Clin Cancer Res, 5, 695–703;
109.                     Momparler R.L. (2003) Cancer epigenetics. Oncogene, 22, 6479–6483;
110.                     Nakayama K., Ishida N., Shirane M. et al. (1996) Mice lacking p27(Kip1) display increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia, and pituitary tumors. Cell, 85, 707-720;
111.                     Nakayama T., Watanabe M., Suzuki H. et al. (2000) Epigenetic regulation of androgen receptor gene expression in human prostate cancers. Lab Invest, 80, 1789–1796;
112.                     Nakayama T., Watanabe M., Yamanaka M. et al. (2001) The role of epigenetic modifications in retinoic acid receptor 2 gene expression in human prostate cancers. Lab Invest 81, 1049–1057;
113.                     Nguyen C.T., Gonzales F.A., Jones P.A. (2001) Altered chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic Acids Res, 29, 4598-4606;
114.                     Nguyen T.T., Nguyen C.T., Gonzales F.A. (2000) Analysis of cyclin-dependent kinase inhibitor expression and methylation patterns in human prostate cancers. Prostate, 43, 233–242;
115.                     Nojima D., Li L.C., Dharia A. et al. (2001) CpG hypermethylation of the promoter region inactivates the estrogen receptor-gene in patients with prostate carcinoma. Cancer, 92, 2076–2083;
116.                     Noordzij M.A., van Steenbrugge G.J., Verkaik N.S. et al. (1997) The prognostic value of CD44 isoforms in prostate cancer patients treated by radical prostatectomy. Clin Cancer Res, 3, 805–815;
117.                     Otterson G.A., Khleif S.N., Chen W. et al. (1995) CDKN2 gene silencing in lung cancer by DNA hypermethylation and kinetics of p16INK4 protein induction by 5-aza 2'deoxycytidine. Oncogene, 11, 1211–1216;
118.                     Paggi M.G., Baldi A., Bonetto F., Giordano A. (1996) Retinoblastoma protein family in cell cycle and cancer: a review. Journal of Cellular Biochemistry, 62, 418–430;
119.                     Pakneshan P., Xing R.H., Rabbani S.A. (2003) Methylation status of uPA promoter as a molecular mechanism regulating prostate cancer invasion and growth in vitro and in vivo. Faseb J, 17, 1081–1088;
120.                     Patra S.K., Patra A., Zhao H., Dahiya R. (2002) DNA metyltransferase and demethylase in human prostate cancer. Mol Carcinog, 33, 163-171;
121.                     Pogribny I.P., James S.J., Jernigan S., Pogribna M. (2004) Genomic hypomethylation is specific for preneoplastic liver in folate/methyl deficient rats and does not occur in non-target tissues. Mutat Res, 548, 53-59;
122.                     Pradhan S., Kim G.D. (2002) The retinoblastoma gene product interacts with maintenance human DNA (cytosine-5) methyltransferase and modulates its activity. EMBO J 21, 779–788;
123.                     Ransohoff D.F. (2003) Cancer. Developing molecular biomarkers for cancer. Science, 299, 1679–1680;
124.                     Rashid S.F., Moore J.S., Walker E. et al. (2001) Synergistic growth inhibition of prostate cancer cells by 1 ,25 dihydroxyvitamin D3 and its 19-nor-hexafluoride analogs in combination with either sodium butyrate or trichostatin A. Oncogene, 20, 1860–1872;
125.                     Rauen K.A., Sudilovsky D., Le J.L. et al. (2002) Expression of the coxsackie adenovirus receptor in normal prostate and in primary and metastatic prostate carcinoma: potential relevance to gene therapy. Cancer Res, 62, 3812–3818;
126.                     Ricciardiello L., Goel A., Mantovani V. et al. (2003) Frequent loss of hMLH1 by promoter hypermethylation leads to microsatellite instability in adenomatous polyps of patients with a single first-degree member affected by colon cancer. Cancer Res, 63, 787–792;
127.                     Rice J.C., Massey-Brown K.S., Futscher B.W. (1998) Aberrant methylation of the BRCA1 CpG island promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA in sporadic breast cancer cells. Oncogene, 17, 1807-1812;
128.                     Richmond P.J., Karayiannakis A.J., Nagafuchi A. et al (1997) Aberrant E-cadherin and -catenin expression in prostate cancer: correlation with patient survival. Cancer Res, 57, 3189–3193;
129.                     Robertson K.D., Ait-Si-Ali S., Yokochi T. еt al. (2000) DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. Nat Genet, 25, 338–342;
130.                     Robertson K.D., Uzvolgyi E., Liang G. et al. (1999) The human DNA methylatransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res, 27, 2291-2298;
131.                     Ross J.S., Figge H.L., Bui H.X. et al (1994) E-cadherin expression in prostatic carcinoma biopsies: correlation with tumor grade, DNA content, pathologic stage, and clinical outcome. Mod Pathol, 7, 835–841;
132.                     Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B. (2000) DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet, 25, 269-277;
133.                     Saito Y., Kanai Y., Sakamoto M. et al. (2002) Overexpression of a splice variant of DNA methyltransferase 3b, DNMT3b4, associated with DNA hypomethylation on pericentromeric satellite regions during human hepatocarcinogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 99, 10060-10065;
134.                     Sakai T., Toguchida J., Ohtani N. et al (1991) Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am J Hum Genet, 48, 880–888;
135.                     Sakr W.A., Haas G.P., Cassin B.F. et al. (1993) The frequency of carcinoma and intraepithelial neoplasia of the prostate in young male patients. J Urol, 150, 379-385;
136.                     Santourlidis S., Florl A., Ackermann R. et al (1999) High frequency of alterations in DNA methylation in adenocarcinoma of the prostate. Prostate, 39, 166–174;
137.                     Saric T., Brkanac Z., Troyer D.A. et al. (1999) Genetic pattern of prostate cancer progression. Int J Cancer,  81, 219-224;
138.                     Sasakawa Y., Naoe Y., Inoue T. et al. (2003) Effects of FK228, a novel histone deacetylase inhibitor, on tumor growth and expression of p21 and c-myc genes in vivo. Cancer Lett, 195, 161–168;
139.                     Sasakawa Y., Naoe Y., Noto T. et al. (2003) Antitumor efficacy of FK228, a novel histone deacetylase inhibitor, depends on the effect on expression of angiogenesis factors. Biochem Pharmacol, 66, 897–906;
140.                     Sasaki M., Tanaka Y., Perinchery G. et al. (2002) Methylation and inactivation of estrogen, progesterone, and androgen receptors in prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 94, 384–390;
141.                     Sathyanarayana U.G., Padar A., Suzuki M. et al. (2003) Aberrant promoter methylation of laminin-5-encoding genes in prostate cancers and its relationship to clinicopathological features. Clin Cancer Res, 9, 6395–6400;
142.                     Schmitt J.F., Millar D.S., Pedersen J.S. et al. (2002) Hypermethylation of the inhibin -subunit gene in prostate carcinoma. Mol Endocrinol, 16, 213–220;
143.                     Schulz W.A., Elo J.P., Florl A.R. et al. (2002) Genomewide DNA hypomethylation is associated with alterations on chromosome 8 in prostate carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 35, 58–65;
144.                     Segura-Pacheco B., Trejo-Becerril C., Perez-Cardenas E. et al. (2003) Reactivation of tumor suppressor genes by the cardiovascular drugs hydralazine and procainamide and their potential use in cancer therapy. Clin Cancer Res, 9, 1596–1603;
145.                     Sekita N., Suzuki H., Ichikawa T. et al. (2001) Epigenetic regulation of the KAI1 metastasis suppressor gene in human prostate cancer cell lines. Jpn J Cancer Res, 92, 947–951;
146.                     Seville L.L., Shah N., Westwell A.D., Chan W.C. (2005) Modulation of pRB/E2F functions in the regulation of cell cycle and in cancer. Current Cancer Drug Targets, 5, 159–170;
147.                     Song M.S., Song S.J., Ayad N.G. et al. (2004) The tumour suppressor RASSF1A regulates mitosis by inhibiting the APC-Cdc20 complex. Nat Cell Biol, 6, 129–137;
148.                     Stirzaker C., Millar D.S., Paul C.L. et al. (1997) Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumors. Cancer Res, 57, 2229–2237;
149.                     Suenaga M., Soda H., Oka M. et al. (2002) Histone deacetylase inhibitors suppress telomerase reverse transcriptase mRNA expression in prostate cancer cells. Int J Cancer, 97, 621–625;
150.                     Suh C.I., Shanafelt T., May D.J. et al. (2000) Comparison of telomerase activity and GSTP1 promoter methylation in ejaculate as potential screening tests for prostate cancer. Mol Cell Probes, 14, 211–217;
151.                     Sun H., Lesche R., Li D.M. et al. (1999) PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-trisphosphate and Akt/protein kinase B signaling pathway. Proc Natl Acad Sci, 96, 6199-6204;
152.                     Tao L., Yang S., Xie M. et al. (2000) Hypomethylation and overexpression of c-jun and c-myc protooncogenes and increased DNA methyltransferase activity in dichloroacetic and trichloroacetic acid-promoted mouse liver tumors. Cancer Lett, 158, 185–193;
153.                     Tavassoli F.A. (1998) Ductal carcinoma in situ: Introduction of the concept of ductal intraepithelial neoplasia. Mol Pathol, 11, 140-154;
154.                     Thelen P., Schweyer S., Hemmerlein B. et al. (2004) Expressional changes after histone deacetylase inhibition by valproic acid in LNCaP human prostate cancer cell. Int J Oncol, 24, 5–31;
155.                     Thibault A., Figg W.D., Bergan R.C. et al. (1998) A phase II study of 5-aza-2'deoxycytidine (decitabine) in hormone independent metastatic (D2) prostate cancer. Tumor, 84, 87–89;
156.                     Tsubaki J., Hwa V., Twigg S.M., Rosenfeld R.G. (2002) Differential activation of the IGF binding protein-3 promoter by butyrate in prostate cancer cells. Endocrinology, 143, 1778–88;
157.                     Tsujiuchi T., Tsutsumi M., Sasaki Y. et al. (1999) Hypomethylation of CpG sites and c-myc gene overexpression in hepatocellular carcinomas, but not hyperplastic nodules, induced by a choline-deficient L-amino acid-defined diet in rats. Jpn J Cancer Res, 90, 909–913;
158.                     Urnov F.D. (2002) Methylation and the genome: the power of a small amendment. J Nutr, 132, 2450S–2456S;
159.                     Van Veldhuizen P.J., Sadasivan R., Cherian R., Wyatt A. (1996) Urokinase-type plasminogen activator expression in human prostate carcinomas. Am J Med Sci, 312, 8–11;
160.                     Verkaik N.S., Trapman J., Romijn J.C. (1999) Down-regulation of CD44 expression in human prostatic carcinoma cell lines is correlated with DNA hypermethylation. Int J Cancer,  80, 439–443;
161.                     Verkaik N.S., van Steenbrugge G.J., van Weerden W.M. et al. (2000) Silencing of CD44 expression in prostate cancer by hypermethylation of the CD44 promoter region. Lab Invest, 80, 1291–1298;
162.                     Vertino P.M., Yen R.W., Gao J., Baylin S.B.(1996) De novo methylation of CpG island sequences in human fibroblasts overexpressing DNA (cytosine-5)-methyltransferase, Mol Cell Biol, 16, 4555–4565; 
163.                     Vis A.N., Oomen M., Schroder F.H., van der Kwast T.H. (2001) Feasibility of assessment of promoter methylation of the CD44 gene in serum of prostate cancer patients. Mol Urol, 5, 199–203;
164.                     Walker C., Nettesheim P. (1986) In vitro transformation of primary rat tracheal epithelial cells by 5-azacytidine. Cancer Res, 46, 6433–6437;
165.                     Wang S.I., Parsons R., Ittmann M. (1998) Homozygous deletion of the PTEN tumor suppressor gene in a subset of prostate adenocarcinomas. Clin Cancer Res, 4, 811-815;
166.                     Wang Y., Hayward S.W., Donjacour A.A. et al. (2000) Sex hormone-induced carcinogenesis in Rb-deficient prostate tissue. Cancer Res, 60, 6008–6017;
167.                     Weiser T.S., Guo Z.S., Ohnmacht G.A. et al. (2001) Sequential 5-aza-2'-deoxycytidine-depsipeptide FR901228 treatment induces apoptosis preferentially in cancer cells and facilitates their recognition by cytolytic T lymphocytes specific for NY-ESO-1. J Immunother, 24, 151–161;
168.                     Woodson K., Hanson J., Tangrea J. (2004) A survey of gene-specific methylation in human prostate cancer among black and white men. Cancer Lett, 205, 181–188;
169.                     Woodson K., Hayes R., Wideroff L. (2003) Hypermethylation of GSTP1, CD44, and E-cadherin genes in prostate cancer among US blacks and whites. Prostate, 55, 199–205;
170.                     Wu J., Issa J.P., Herman J. et al. (1993) Expression of an exogenous eukaryotic DNA methyltransferase gene induces transformation of NIH 3T3 cells, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 8891–8895;
171.                     Xu W., Cho H., Evans R.M. (2003) Acetylation and methylation in nuclear receptor gene activation. Methods Enzymol, 364, 205–223;
172.                     Yamanaka M., Watanabe M., Yamada Y. et al. (2003) Altered methylation of multiple genes in carcinogenesis of the prostate. Int J Cancer, 106, 382–387;
173.                     Yang E.S., Burnstein K.L. (2003) Vitamin D inhibits G1 to S progression in LNCaP prostate cancer cells through p27Kip1 stabilization and Cdk2 mislocalization to the cytoplasm. J Biol Chem, 278, 46862–46868;
174.                     Yao X., Hu J.F., Daniels M. et al. (2003) A methylated oligonucleotide inhibits IGF2 expression and enhances survival in a model of hepatocellular carcinoma. J Clin Invest, 111, 265–273;
175.                     Yegnasubramanian S., Kowalski J., Gonzalgo M.L. et al. (2004) Hypermethylation of CpG islands in primary and metastatic human prostate cancer. Cancer Res, 64, 1975–1986;
176.                     Zhang J., Liu L., Pfeifer G.P. (2004) Methylation of the retinoid response gene TIG1 in prostate cancer correlates with methylation of the retinoic acid receptor gene. Oncogene, 23, 2241–2249;
177.                     Zhao X.Y., Peehl D.M., Navone N.M., Feldman D. (2000) 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 inhibits prostate cancer cell growth by androgen-dependent and androgen-independent mechanisms. Endocrinology, 141, 2548–2556;
178.                     Zhu X., Leav I., Leung Y.K. et al. (2004) Dynamic regulation of estrogen receptor-expression by DNA methylation during prostate cancer development and metastasis. Am J Pathol ,164, 2003–2012.

БАД НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВОМ. Имеются противопоказания. Перед применением проконсультруйтесь со специалистом
+7 (495) 721-20-58
Консультация по телефону
АО «ИЛЬМИКСГРУПП»
2017 ИНДИГАЛ.ru